熒光全內反射技術詳解

大于臨界角的光線從高密介質向低密介質時，在界面處并不是所有的光都被反射，而是有一部分光會穿透介質表面，到達低密介質內，但這部分光的強度會隨著穿透深度的增加而成指數級迅速衰減，我們稱這部分光為消逝波消逝波消逝波。全內反射熒光顯微鏡利用全內反射產生的消逝波場來照明樣品，從而致使在百納米級厚的光學薄層內的熒光團受到激發，熒光成像的信噪比大大提高。

細胞學研究中經常使用共聚焦顯微鏡研究薄層切片，但共聚焦的激發光要穿透整個標本，然后通過在采集端進行遮擋的方法采集薄層圖象信息。受到光學顯微鏡衍射極限的限制，共聚焦顯微鏡的軸向分辨率約為350nm左右。共聚焦需要在熒光采集端進行阻擋和分光等設置，往往采集熒光的光路很長采集效率很低，因而需要使用較強的激發光去照射標本，標本的殺傷和熒光的漂白都很明顯。另外共聚焦受到掃描速度和采集效率的限制往往采集圖象速度較慢，不能快速的獲得清晰的微弱熒光圖象

TIRF的特點就是利用薄層激發，激發光能夠照亮的范圍只有百納米級，因此更深層的熒光不會干擾我們要觀察的表面信號，而且這種薄層激發對標本的殺傷也很小。TIRF顯微鏡采集信號時通常是直接使用離物鏡最近的側光口采集熒光，因此采集的熒光信號背景極低、熒光損失極小，也就是有很高的圖象信號噪音比（信噪比、S/N）。TIRF技術通常使用量子效率達到90％的背感光高敏感度的EM-CCD，通過高效采集和高敏感的電子放大技術可以高速的獲取極弱熒光圖象。

TIRF技術非常適合活細胞相關的膜表面成像、囊泡運輸、胞吞胞吐作用、病毒侵染和單分子熒光成像等相關研究。

 

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