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幾種顯微鏡的使用方法和區別1.熒光技術
（1）熒光原理
熒光分子吸收入射光能量后,電子由基態躍遷到激發態。激發態電子不穩定,會自發躍遷回基態,并輻射熒光。輻射熒光λ＜入射光λ。
（2）熒光探針
①熒光素 如:羅丹明B
②熒光蛋白 如:綠色熒光蛋白（GFP）
（3）熒光分類
①自發熒光:如葉綠素、血紅素等熒光分子經紫外線照射后,能夠自發輻射紅色熒光。
②誘發熒光:物質經熒光染料染色后,再經紫外線照射,進而輻射熒光。
2.熒光顯微鏡
（1）熒光顯微鏡概述
熒光顯微鏡是指利用短波長電磁波為光源,激發樣品輻射熒光,之后利用樣品產生的自發熒光或誘發熒光,對細胞內特異性蛋白質進行定性與定位研究的裝置。
（2）熒光顯微鏡的特殊構件
①石英透鏡
②濾光片系統
激發濾片,位于光源與樣品之間,濾過可見光,只允許作為光源的紫外光通過。
（3）熒光顯微鏡的特點
①優點:熒光顯微鏡主要用于定性、定位研究細胞內特異性蛋白質?？梢杂^察活細胞。
②缺點:無法排除來自樣品焦平面以外的熒光,使得圖像的反差與分辨率降低。
3.激光掃描共焦顯微鏡
（1）激光掃描共聚焦顯微鏡概述
激光掃描共焦顯微鏡是指以激光為光源,對樣品進行逐點、逐行、逐面掃描成像的裝置。其物鏡與聚光鏡共焦點,以提高分辨率。通過調節焦平面即可獲得樣品不同層次的圖像,通過計算機分析和模擬,可以構筑樣品的三維圖像。
（2）激光掃描共焦顯微鏡的成像原理
①光源為激光,經雙色鏡反射后,通過物鏡匯聚于樣品某一焦點,激發熒光。樣品所激發的熒光經透鏡匯聚成像,通過共焦小孔被檢測器檢出。
②物鏡與聚光鏡共焦點,使得只有從樣品焦平面發出的熒光聚焦成像,其他部分的激發熒光不能通過共焦小孔,檢測器不能檢出。
（3）激光掃描共焦顯微鏡的特點
①分辨率比普通熒光顯微鏡提高1.5倍。
②通過改變焦平面,可以獲得樣品不同層次的圖像,從而可以構筑樣品的三維圖像。
③可以實現長時間活細胞動態觀察。
一、透射電子顯微鏡
1.透射電子顯微鏡概述
透射電子顯微鏡（TEM）是指利用電子槍發出的高能電子束照射超薄樣品,透射電子經電磁透鏡多次放大后成像的裝置。其原理為樣品不同部分對電子束的散射程度不同。主要用于觀察樣品精細結構
透射電子顯微鏡的分辨本領是指電鏡處于最佳狀態時的分辨率。
2.透射電子顯微鏡的基本構造
（1）照明系統:電子槍、聚光鏡
（2）成像系統:電磁透鏡（物鏡、中間鏡、投影鏡等）
（3）真空系統
（4）記錄系統:熒光屏 or 感光底片
3.透射電子顯微鏡的樣品制備
（1）超薄切片技術:固定→包埋→切片→染色
①固定:使樣品的形態、結構與性質盡可能不發生變化。
固定劑的種類:鋨酸、戊二醛、高錳酸鉀
②包埋:使樣品的精細結構在切片中得到支撐,獲得的超薄切片連續完整并有足夠的強度,耐電子轟擊、耐高溫、耐真空蒸發。包埋前常需脫水處理。
包埋劑的要求:
A.高倍放大時不顯示本身結構
B.聚合時不發生明顯收縮
C.具有良好的機械性能
包埋劑的種類:環氧樹脂
③切片:切片厚度的調控通常通過金屬熱膨脹或機械伸縮。
④染色:通常通過重金屬鹽對樣品染色以形成明暗差,得到黑白圖像。
常用重金屬鹽
A.鋨酸 - 脂質
B.鉛鹽 - 蛋白質
C.醋酸鈾 - 核酸
（2）負染色技術
負染色技術是指對背景染色的技術。通過用重金屬鹽對鋪展在載網上的樣品染色,使電子密度高的重金屬鹽布滿整個載網,而凸出載網表面的樣品則沒有染料沉積,從而使背景散射電子能力增強,而樣品散射電子能力減弱,以此襯托出樣品的精細結構。
負染色技術適合于觀察生物大分子組成的結構,如:病毒、核糖體等。
（3）冰凍刻蝕技術
冰凍刻蝕技術主要用于觀察膜斷面表面形貌與膜斷面蛋白質,樣品無需包埋、固定,能夠更好的反應樣品的真實結構。
①冰凍斷裂:在液氮中將樣品迅速冷凍,之后在低溫、真空環境下用冰刀將其切斷。由于斷面的冰在真空中少量升華,可以增強刻蝕效果。
②刻蝕復型:用金屬鉑進行傾斜噴涂,以形成電子反差,再用碳垂直于斷面進行真空噴涂,形成連續碳膜,以復制樣品的表面形貌。再用消化液消除樣品本身,之后將之移到載網上用電鏡觀察。
二、掃描電子顯微鏡
1.掃描電子顯微鏡概述
掃描電子顯微鏡（SEM）是指利用高能電子束掃描樣品,激發樣品表面產生二次電子,進而依據樣品不同部位產生二次電子數量的多少而成像的裝置。主要用于觀察樣品表面形貌。
2.掃描電子顯微鏡的樣品制備
（1）噴鍍技術
在樣品表面噴涂一層金膜,以增強其導電性。
（2）CO2臨界點干燥法
將樣品浸入液態CO2中,在臨界溫度之上使CO2以氣態逸出,由于沒有氣液相面產生,因此不存在表面張力,故能夠保持樣品的表面形貌。
1.相差顯微鏡
（1）相差顯微鏡概述
相差顯微鏡是指利用光線的干涉、衍射特征,使相位差轉變為振幅差,增強樣品的明暗對比,從而觀察無色透明樣品的裝置。
（2）相差顯微鏡的特殊構件:相差板、環狀光闌
相差顯微鏡在物鏡后裝有相差板,相差板部分區域有吸光物質,使得光線分別通過相差板不同區域時相位差增大,匯聚后經疊加使振幅增大或減小。從而將相位差轉變為振幅差,增強樣品的明暗對比。
（3）相差顯微鏡的優點:樣品無需染色,可觀察活細胞及細胞器動態。
2.微分干涉顯微鏡
（1）微分干涉顯微鏡概述
微分干涉顯微鏡是指以平面偏光為光源,光源經棱鏡后分為兩束,在不同時間經過樣品相鄰部位,再經過另一棱鏡后會合,從而使樣品的厚度差轉變為振幅差,增強樣品的明暗對比,從而觀察無色透明樣品的裝置。
（2）微分干涉顯微鏡的優點
①適合觀察活細胞內較大的細胞器。
②分辨率比普通復式顯微鏡提高一個數量級。
3.錄像增差顯微鏡
錄像增差顯微鏡是指:在微分干涉顯微鏡的基礎上引入計算機輔助錄像,從而觀察記錄活細胞內細胞器活動的裝置。如:顆粒在微管上運動。
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